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教你撩5分傻白甜~

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作者：Lucky King（本文为读者来稿，转载请注：解螺旋·医生科研助手）

这一期本打算讲解一篇Nature上30多分的paper，后来想想此等白富美也只有高富帅（大牛导师、好的实验室、经费充足、自身聪明上进）才好撩到。So，4.652的傻白甜学习下，小大夫&小青椒们一年撩两篇也足够了。

本文题目是：LPS刺激诱导结肠癌细胞模型中，通过增加NF-κB与VEGDR-3启动子结合的机制，上调VEGDR-3表达进而促进细胞的迁移与侵袭（回复“0328”可下载文献）。

一、实验假说

通过免疫组化观察结肠癌患者临床样本VEGFR-3表达，在癌旁组织和正常大肠黏膜细胞中，VEGFR-3不表达或者表达量很低（Fig.1 A）；在大肠癌组织中VEGFR-3的表达呈阳性或高（Fig.1 B）。因此，VEGFR-3的表达可能促进结肠癌的发展。

二、结果解读

表2临床数据结直肠癌组织和正常结肠直肠组织中的VEGFR-3表达情况。* P <0.05

表2

Fig.1

建立体外细胞模型：用LPS（脂多糖）刺激sw480和HCT116两种结肠细胞系，通过q PCR和WB检测VEGFR-3的mRNA和蛋白表达量。

Fig.2 A&B：sw480和HCT116细胞中VEGFR-3的mRNA和蛋白表达水平量近似；

Fig.2 C&D：LPS刺激sw480细胞中VEGFR-3 mRNA和蛋白表达，且随LPS剂量增加；

Fig.2 E& F：LPS刺激HCT116细胞中VEGFR-3 mRNA和蛋白表达水平，且随LPS剂量增加；

两个结肠癌细胞模型成功建立。

Fig.2

在LPS诱导的细胞模型中，VEGFR-3在促进细胞的迁移和侵袭过程中具有非常重要的作用Fig.3（A-D）Cell proliferation assay，LPS处理sw480和HCT116，不影响细胞增殖；使用Transwell法检测LPS诱导细胞模型sw480和HCT116的迁移和侵袭能力：Fig.3（E&F）模型组（LPS刺激）细胞迁移与侵袭总数明显高于正常组（无LPS）；在模型组中添加VEGFR-3抗体IgG（LPS-800ng-IgG），阻断其生物活性，细胞迁移与侵袭总数显著下降。表明VEGFR-3参与细胞迁移与侵袭的过程。

Fig.3

Fig.4(A) 蛋白质印迹实验表明模型组中LPS受体TLR4蛋白表达；

Fig.4(B) 与正常组对比，模型组NF-κB表达水平没有明显差异；p-NF-κB表达明显升高。

LPS通过TLR4受体激活NF-κB。

Fig.4

构建VEGFR-3基因启动子5'端部分缺失的一系列载体，转染到细胞系中。

Fig.5 (A)将包含不同VEGFR-3启动子片段质粒转染细胞pGL3B-1659…..pGL3B-59和pGL3-Basic(无启动子、对照) ，质粒为肾素荧光素酶表达载体pRL-TK。pGL3B-1659、pGL3B-1159、pGL3B-834、pGL3B-609、pGL3B-334、和pGL3B-159组荧光强度显著高于pGL3B-59和pGL3B-Basic。pGL3B-159相对于pGL3B-1659（全长启动子）具有高荧光素酶活性，表明-159碱基至+65碱基区域是VEGFR-3启动子具有活性的重要区域。选择质粒pGL3B-159用于下一步研究。pGL3B-59质粒转染细胞中的荧光素酶活性远低于pGL3B-159，表明VEGFR-3启动子中该区域（-159nt至-59nt）有重要作用。作者使用生物信息学软件搜索，认为该区域可能是转录因子结合位点。

Fig.5（B）VEGFR-3启动子部分核苷酸序列，-137碱基到-128碱基是NF-κB结合位点在。

Fig.5（C）将VEGFR-3启动子序列中NF-κB结合位点进行突变，构建pGL3B-159-mut质粒。pGL3B-159-mut与对照未突变质粒pGL3B-159相比，结合位点的突变导致VEGFR-3启动子活性降低约40％。表明NF-κB结合位点对pGL3B-159质粒的活性非常重要。

Fig.5（D&E）LPS处理，pGL3B-159质粒活性显着增加，并且具有浓度依赖性。

Fig.5

为了验证NF-κB在VEGFR-3启动子活性中作用，构建超表达载体PcDNA3.0-NF-κB和基因沉默载体siRNA-NF-κB。PcDNA3.0-NF-κB超表达组，NF-κB表达量显著增加Fig.6(A)；siRNA-NF-κB组，NF-κB表达量显著降低Fig.6(C)。

将pGL3B-159质粒分别与PcDNA3.0-NF-κB质粒、siRNA-NF-κB质粒共转染sw480细胞，检验荧光强度：NF-κB超表达组（PcDNA3.0-NF-κB）荧光强度显著高于对照，NF-κB的过表达增加VEGFR-3启动子的活性 Fig.6(B)；小RNA干扰组（siRNA-NF-κB）荧光强度强度显著降低，降低VEGFR-3启动子活性Fig.6(D)。

将过表达质粒（pcDNA3.0-NF-κB）分别与pGL3B-159、pGL3B-159-mut（NF-κB结合位点突变）共转染sw480细胞。随着pcDNA3.0-NF-κB 浓度的增加，pGL3B-159组荧光增强并表现出剂量依赖性Fig.6(E)，而pGL3B-159-mut组没有Fig.6(F)。结果表明，VEGFR-3启动子活性与NF-κB有关，并具有浓度依赖性。